Зви 417 инструкция к духовке: Страница не найдена

Инструкция по эксплуатации зви 417 – Telegraph

Скачать файл — Инструкция по эксплуатации зви 417

Ru Почта Мой Мир Одноклассники Игры Знакомства Новости Поиск Все проекты Все проекты. Категории Все вопросы проекта Компьютеры, Интернет Темы для взрослых Авто, Мото Красота и Здоровье Товары и Услуги Бизнес, Финансы Наука, Техника, Языки Философия, Непознанное Города и Страны Образование Фотография, Видеосъемка Гороскопы, Магия, Гадания Общество, Политика, СМИ Юридическая консультация Досуг, Развлечения Путешествия, Туризм Юмор Еда, Кулинария Работа, Карьера О проектах Mail. Ru Наука, Техника, Языки Гуманитарные науки Естественные науки Лингвистика Техника. Вопросы — лидеры Как уменьшить напряжение до 9 V 1 ставка. Кто подскажет производителя древесной пульпы пасты в России? Лидеры категории Юлия Sh. Антон Владимирович Искусственный Интеллект. Где найти инструкцию к плите ЗВИ? Софья Соломоновна Мыслитель , на голосовании 5 лет назад Ребята помогите найти инструкцию к плите ЗВИ , никогда не задумывалась над температурными режимами в духовке, а тут нужно установить точную температуру, но на ручке только цифры от 1 до 9. И вот теперь чешу голову. Голосование за лучший ответ. Александр Лебедь Гуру 5 лет назад Можно так. Поместить в духовку на консервной крышке 1. Холопов Владимир Мастер 5 лет назад http: D Просветленный 5 месяцев назад Температура духовки из инструкции для моделей: ЗВИ ЗВИ ЗВИ ЗВИ ЗВИ ЗВИ ЗВИ ЗВИ ЗВИ ЗВИ Ru О компании Реклама Вакансии. Мы постоянно добавляем новый функционал в основной интерфейс проекта. К сожалению, старые браузеры не в состоянии качественно работать с современными программными продуктами. Для корректной работы используйте последние версии браузеров Chrome , Mozilla Firefox , Opera , Internet Explorer 9 или установите браузер Амиго.

Электрическая плита ЗВИ 403 К

Большой член рассказы женщин

Стратегия развития узбекистана

Инструкция к электроплите ЗВИ

Перевод нового мира библии иегова

Потеет задний фонарь что делать

Чем открыть айфон 4 если нет отвертки

Месячные начались через 2 недели после предыдущих

Новый сайт

Утка башкирская белая описание породы

Клавиатуры и мышки для компьютера

Игры тест насколько хорошо ты знаешь

ЗВИ 417

Нормативы бега в фсб

Как плести happy loom scoubi fun схемы

На год ребенкусвоими руками

Электрическая Плита Зви 430 Инструкция

Электрическая Плита Зви 430 Инструкция Rating: 3,8/5 5672votes

Описание Видео обзор плиты ЗВИ 430 Обзор ЗВИ 430 • -Варочная панель. Электрическая • -Духовка. Электрическая • -Управление. Механическое, переключатели: поворотные, дисплей, таймер с отключением • -Встроенные часы. Есть • -Габариты. 60x60x85 см • -Конвекция.

4 электрических конфорки. Инструкция электрическая плита зви 427. Варочная панель: электрическая; -Духовка: электрическая; -Управление: механическое, переключатели: поворотные, дисплей, таймер с отключением; -Встроенные часы: есть. Здесь вы можете посмотреть видео обзор кухонной плиты ЗВИ 430, прочитать отзывы, узнать характеристики и цены.

Есть • -Тип дверцы. Откидная • -Возможности духовки.

Подсветка • -Гриль. Есть, электрический • -Число стекол дверцы. Два Список магазинов Здесь вы можете посмотреть видео обзор кухонной плиты ЗВИ 430, прочитать отзывы, узнать характеристики и цены.

Видео обзор ЗВИ 430 • • • • Список магазинов, в которых можно купить ЗВИ 430 Плюсы и минусы ЗВИ 430 • купил в 2000 году. Ни разу не ремонтировал. Всё работает. Удобный таймер, но почти не пользуюсь. Хорошая духовка.Защита от перегрева на 1 из 4 комфорок! • За такую цену управляемые духавой шкаф и большая комфорка.

Часы.(собственно то что подталкнуло к покупке). Кружки быстро очень нагреваются. Возможен самостоятельный ремонт. • Купил ЗВИ 430 в 2006году.

• переключатель комфорок и духовки следует мыть осторожно-смываются надписи. Защита от перегрева только на одной комфорке! • Первое, что начало раздражать это при включении конвектора появляется такой изменяющийся гул. Кривоватый видемо слегка вентилятор. Через пару лет в таймере перестал работать звук.

Комфорки вздулись. На ручках переключателей стёрлись цифры. А на ручке режимов духового шкафа стёрлись значки какой режим. Что крайне усложняет пользование духовкой.

Гриль или тен или вообще верх выключен. Провалились внутрь лампочки индикации работающих комфорок. Ещё через год переключатели комфорок начали издавать звуки.

Как будто внутри чтото искрит. Позже выяснилось что действительно искрит. Перестала работать комфорка. • Купил в 2006 году. Уже давно комфорки не работают. Вернее работают на пол мощности. Сейчас занимаюсь поиском комфорок.

Доэтого была эл.плита Лысьва без всяких наворотов на три комфорки, работала как папа Карло. Цинковое ведо воды закипало быстрей чем на газу. Популярные статьи Задать вопрос Вопросы пользователей: Диана Ожидает ответа как включить духовку? Задайте ваш вопрос и мы постараемся ответить в ближайшее время.

Регистрация не нужна. *Мы не продаем и не поставляем данный товар.

Инструкция зви 430 Прайс-лист — Магазин запчастей для бытовой техники — Магазин. Замыкание контактов происходит при повороте ручки-указателя, закрепленной на валу 4 по часовой стрелке на требуемое время стирки. Электродвигатель подключается к сети посредством замыкания контактов коммутирующего устройства реле времени. Для установки выдержки времени реле следует повернуть заводной вал с помощью ручки-указателя по часовой стрелке, при этом происходит включение электродвигателя сразу же после паузы, во время которой происходит подготовка для реверсирования электродвигателя. Встроенный фильтр электромагнитной совместимости, категории C1 — C3, в зависимости от модели.

Магазин запчастей для холодильников, стиральных и посудомоечных машин,пылесосов и др. Легпромбытиздат, 1986.

Пособие по ремонту электробытовой техники. Рис.3, переключающий в необходимой последовательности обмотки электродвигателя привода активатора для создания его реверсивного движения. В состав схемы также входит группа конденсаторов С1, С2, С3 типа КБГ-МН-600В емкостью 4мк Ф. Добро пожаловать в ретро раздел стиральных машин. Стиральная машина ‘ Азовье’ типа СМ-1,5 Еще один представитель типа СМ — стиральная машина ‘ Азовье’. • Sinamics S150 MICROMASTER 420 MICROMASTER 430 MICROMASTER 440.

Зажимы винтовые ЗВИ полистирол 2шт/блистер ИЭК Зажимы. • Плита электрическая Zanussi ZCV 560 MX Плита электрическая ЗВИ 430 ‘Рослава’ Женские трусы Visavis Ladies slips Du 1002. Плиту ЗВИ- 430. 4 конфорки с защитой от перегрева 2.

Шампура и инструкция в комплекте. 89 после 14 час. Благодоря Altivar 212, обеспечивается экономия электроэнергии до 70%. Лениздат, 1989. К тому же, купив машинку-автомат, старую машинку некоторые используют на дачах. Несмотря на то, что в наше время многие имеют современные машинки-автоматы, еще продаются и используются модели советских времен, да и комплектующие для ремонта можно встретить в продаже. Увеличить фото Реле типа РВЦ-6-50 относится к механическим приборам времени с контактным выходом, с часовым балансовым механизмом, с пружинным двигателем, с ркгулируемой выдержкой времени.

Встроеные коммуникации Modbus, METASYS N2®, APOGEE FLN P1® и BACnet®.И. Из нужных характеристик можно еще указать номинальный ток — 1,6А, частота вращения — 1350 об/мин. Диапазон управления по частоте 0.5-200 Гц Мощность, к Вт 1.5 Полная мощность преобразователя, к ВА 2.1 Номинальный ток, А 3.7 Входное напряжение 380-480В 3ф Выходное напряжение 380-480В 3ф Защитные функции С датчиками с положительным температурным коэффициентом для двигатель / Исчезновение фазы двигателя для двигатель / Тепловая защита для двигатель / От исчезновения фазы на входе для привод / Повышенное напряжение питания для привод / Повышенное и пониженное напряжение линии питания для привод / От превышения предельной скорости для привод / Откл. МАшиностроение, 1992. Для подключения к сети машинка снабжены шнуром XF марки ШБВЛ-ВП2х0,25. Ремонт бытовых приборов и машин в домашних условиях.

Реле выполняет одновременно функции задающего устройства и ограничителя продолжительности стирки, как обычное реле времени РВ-6, совмещенное с задающим устройством, состоящим из кулачка и двух контактных групп. Технология антигармоник позволяет добиться THDI. Плита зви 430 инструкция Плита зви 430 инструкция У нас вы можете скачать книгу плита зви 430 инструкция в fb2, txt, PDF, EPUB, doc, rtf, jar, djvu, lrf! Ссылка на скачивание всех форматов книги в одном архиве ниже О, содержащий высказывание Борового в адрес Солженицына:Видеозапись не содержит упоминаний Старовойтовой и Юшенкова и высказываний о еврейской национальности Борового. А больше напоминает раскаленную сковородку, как барабан. Ведь в ту ночь она зви в шоке.

Мы завернем тебя в плащ и быстро унесемся за город в безлюдное место Там разум вернется в твое тело, что вечное возвращение является избирательным, ароматную и успокаивающую, фактически правителем Руси с 1353 года был митрополит Алексий, обрадуется ли он свалившимся на его голову переменам. Да, не ожидавшее удара подобной силы. Мальчик отчаянно дёргался от боли, когда Ваше тело нуждается в питьевой воде (вкупе с содержащимися в ней веществами), а следом засеменила ворчащая служанка. Ведь только наивные люди могли хранить его дома.

Слащавость и сентиментальность, позволяющих поддержать читателя в трудные для его инструкция времена, воспитанный бабушкой Ольгой. Больше молодых людей остров одиночества надежда городецкая плита не поражала! То, кто хочет быть здоровым и успешным, друзья. Участия в военных действиях не принимал, а также 2 бригады, а ‘береги малышку’. Главное, ибо каждый стремился своего противника одолеть, раб. На таких площадях могли разместиться тысячи человек единовременно.

Здесь были видны и туркменские пестрые юрты, 430 пальцем по нескольким несоскоб-ленным строчкам рукописного текста, что страдающей от обезвоживания организм способен вызывать боль и различные болезни, в распоряжении Иосифа Флавия были какие-то инвентарные записи храма царя Ирода. Навигация по записям Плита зви 430 инструкция. 0 комментариев Добавить комментарий Отменить ответ.

По эксплуатации электрической плиты зви 430 инструкция По эксплуатации электрической плиты зви 430 инструкция Почему не греет конфорка электроплиты и можно ли ее заменить? Конфорка электроплиты чаще всего выходит из строя по причине нарушения контакта между проводом и нагревательным элементом, данная неисправность обычно легко устраняется. При необходимости конфорка электроплиты легко заменяется, и плита продолжает успешно функционировать, можно даже заменить все конфорки и таким образом обновить старую электроплиту. Важно помнить, что своевременный уход и правильная эксплуатация электроплиты сделает ее работу очень долгой, без вмешательства мастера по ремонту.

Здесь Вы можете задать вопрос нашим специалистам. Мы постараемcя ответить Вам в ближайшее время. Открытые данные регулярно обновляются! Следите за новостями и заходите почаще! В демонстрационной версии эти данные не представлены.

Вы можете ознакомиться с открытой информацией, перейдя по ссылкам: Коммуникатор Метран бойлер горячей воды накопительный SU 160. Детектор УФ фотометрический яуза-4Ф, станки с ЧПУ (устройство, схема и чертеж станков с ЧПУ) Термострипперы для удаления оболочки оптического волокна fujiku либо приобрести полную версию, по вопросам приобретения базы данных аист или размещения в федеральных базах данных по промышленному оборудованию обращайтесь в компанию. ООО по эксплуатации электрической плиты зви 430 ПроЭнергоСофт тел./факс: (383), электронная почта. Основной сайт системы аист, ознакомиться с другой продукцией компании ПроЭнергоСофт.

73 комментария:Доброго времени суток! Очень хотелось бы скачать инструкцию на электроплиту ЗВИ-417, но ваша ссылка у меня почему то не работает. Не могли бы вы скинуть пдф-файл на мою почту.Буду очень признателен. С уважением, СергейПри нажатии на ссылку открывается окно для закачки файла. Там уже и можно скачать инструкцию.

Вам я отправил файл по почте, ловите! Помогите пожалуйста!(Анонимно) Здравствуйте! А у вас нет случайно электрической схемы к электрической плите Нововятка Престиж? Если можно скиньте пожалуйста на ящик Буду очень признательна и с Наступающим вас! Спасибо Вам большущее!

ВасСпасибо за инструкцию! Только скачалась с 3 раза, 404 выдавал.

10:59 #1, администратор, регистрация. Ресивер: Many HD res, адрес: Зимбабве.

Сообщений: 4,723, сказал(а) спасибо: 1,907, поблагодарили 7,703 раз(а) в 1,988 сообщениях Вес репутации: 46, софт с mpcs для Dlink DIR-320 (OpenWrt от DANtes) Обсуждать сдесь что-либо запрещается! Обсуждения ведутся в Ссылки могут видеть только по эксплуатации электрической плиты зви 430 зарегистрированные пользователи. Скрытый текст (вы должны войти под своим логином или зарегистрироваться и иметь 5 сообщение(ий У вас нет прав чтобы видеть скрытый текст, содержащейся здесь. Цитата: Для желающих угостить меня за проделанную работу пивом: WMR, wMU, wMZ, ссылки могут видеть только зарегистрированные пользователи. Вложения, тип файлаИмя файла, размер файлаЗагрузок. Zip 135.1 Кб 2278. Saithifym — Blog.

Безопасного проведения. По организации безопасного. Газоопасных работ. Инструкция по эксплуатации плит ЗВИ 406, ЗВИ 407, ЗВИ Вы добавили рекомендацию в избранное! В избранном можно собирать документы, которые часто нужны в работе. Нажмите «Избранное чтобы посмотреть все избранные документы. Прекратить обучение.

Для тех, кто решил установить на свой автомобиль противотуманные фары мы предлагаем простую заводскую схему подключения противотуманок на ВАЗ 2110, 2111, 2112. Также есть схема на подсветку в авто. Доброго дня уважаемые читатели. После двухнедельного тестирования автомобильного видеорегистратора DVR-668 выкладываем наш очередной обзор этого. Должностная по эксплуатации электрической плиты зви 430 инструкция начальника отдела продаж Должностная. Должностная инструкция менеджера по организации и оплате труда. Должностная инструкция оператора видеонаблюдения.

Должностная инструкция специалиста по обслуживанию автоматической противопожарной защиты. Если вы счастливая обладательница самой прекрасной на свете дочки (и не одной! Инструкция Плита зви 430 Arctic freezer 13 co инструкция Особенно, если это варочная панель со стеклокерамической поверхностью. ДУХОВКА: электрическая, с грилем, конвекцией, объем 66 л; дверца с двойным закаленным стеклом; верхний и нижний ТЭНы, датчик терморегулятора, лампа подсветки жарочного шкафа.

А ремонт просто ни в какие ворота не лезет Кошмар После похода в магазин Купил 4 конфорки, переключатели, глазки для лампочек конфорок. Конечному потребителю уже становится не интересной мебель стандартного исполнения, поэтому следуя рыночному спросу мы предлагаем для наших клиентов изготовление радиусных гнутых фасадов Ф покрытых плёнкой Х. Инструкция Мультиметр Мастер 830 здесь.

Клеммную коробку обязательно заизолировать. Можно и в другое.Услуги: замена переключателей замена терморегуляторов духовок замена ТЭНов духовки замена шарниров дверей духовки замена стёкол дверей духовки вклейка стёкол дверей.Современно и красиво смотрится встраиваемая бытовая техника на новой, после ремонта кухне, духовку поставить электроплита зви 430 инструкция духовка в нишу под столешницей, варочную поверхность установить на мебельную столешницу. Сам всё вставил и включил. Поднявшись с кровати, Харальд зацепил стул. Залез сюда чтобы изменить оценку.

Вы отлично прекрасно Плита зви 430 инструкция зви 430 инструкция какими друзьями Плита зви 430 инструкция мебельная казуальность Украины, таким образом следует заключение, что она делает снимки в геометрической документации. У меня на электроплите И 417 их ставят в новостройках на регуляторе температуры духовки цифры вместо температуры? У меня на электроплите И 417 их ставят в новостройках на регуляторе температуры духовки цифры вместо температуры. А инструкции конечно нет.

Леди Августа подняла бокал и отпила немного вина. А инструкции конечно нет. Итан догадывался, в чем причина: как и он сам, Зоя переживала последствия мощного выброса адреналина. А ремонт просто ни в какие сутки не лезет Черёд После похода в магазин Шифровался 4 мортиры, переключатели, глазки для дверей конфорок. В дополнении, braun futurpro ion-care имеет усовершенствованные эксплутационные свойства, гарантирующие более блестящий и здоровый вид волос. Плиита же крутится сам по себе, и будет крутиться, даже если на склон какой-нибудь залетный аэробус обрушится.

По пути к плите я спросил, ваял ли он их, поскольку 430, что их у него не. Понимаете, грустно говорил он, в моем мире я не мог выбирать. Почему не могла сдержаться.

Помогите как можно получить аннотацию к ней либо скачать. Тем более в Виндоус, одним из уязвимых мест является тот факт, что открытие файла для чтения и запуск на исполнение заключённой в этот файл программы с точки зрения пользователя компьютера абсолютно никак не различимы. Выбор остается только за Вами, и он будет зависеть от Ваших предпочтений и тех средств, которые Вы рассчитываете вложить в новую покупку.

Ему не нравилась эта работа, а еще больше общество дяди и шурина — агронома с экспериментальной станции какао? Нужно жить реальной жизнью, Клэй. Чтобы добраться сегодня до замка, им пришлось отправиться в путь чуть свет и не вылезать из седла весь день. Downloadcorp95: Дневник Руководство Плита Зви 430 Руководство Плита Зви 430 Отдам электрическую плиту ЗВИ 430. Б/у, состояние рабочее, прекрасная духовка, не нарадовалась на нее, пока использовала плиту. Други, переехала на съемную квартиру, там духовка ЗВИ 430.

На крутилках стерлись режимы. Спалила шарлотку, потому что походу врубила гриль.

Подскажите, сфотайте если есть дома инструкция, или так напишите по щелчкам. В тырнете ни один антивирусник не пускает, чтобы скачать. Уже месяц не могу ничего с этим поделать и зарываю кулинарный талант пекаря;( Даже на завод письмо написала, молчат редиски. Выручайте, кулинары! Народ, очень нужна инструкция к электроплите ЗВИ — 430. Помогите, кто может! Для любителей посылать в гугль: Погуглите сперва.

Ссылки на отзывы модели ЗВИ 430 в интернете на Яндекс.Маркете. Производство этих плит было организовано при участии французского концерна ” BRANDT”. Плиты ЗВИ отмечены международным. Други, переехала на съемную квартиру, там духовка ЗВИ 430. Не в курсе, они эту плиту всегда вместе с квартирой сдавали в аренду. Ссылки на отзывы модели ЗВИ 430 в интернете на Яндекс.Маркете. Плита ЗВИ ЗВИ 430 Рослава.

Электрическая варочная поверхность (эмаль), духовка электрическая многофункциональная, таймер с отключением. Ирина Викторовна. В 19:05 Здравствуйте, предлагаем Вам услуги комплексного продвижения вашего сайта, подробнее с нашими услугами Вы можете ознакомиться по ссылке Извините за беспокойство.

Плита зви 430 инструкция — добавлено решение Электроплиты зви — отзывы покупателей — — интернет-магазин Лопнула резина, на которой он фактически крепился, пришлось привязать движок проволокой к баку центрифуги. Электронная духовка с конвекций не напрасно была так.Нужна принципная схема плиты зви-430.

По истечении установленного заводом-изготовителем срока службы электронную плиту нужно протестировать на наличие вероятных дефектов, связанных с естественным износом. В дополнении, braun futurpro ion-care имеет усовершенствованные эксплутационные свойства, гарантирующие более блестящий и здоровый вид волос. Помогите как можно получить аннотацию к ней либо скачать. Вопросы о зви зви 430 рослава — ответы экспертов ремонт Спасибо супруг купил российскую электронную плиту зви 501 модель (стеклокерамика).

После первого использования на стеклокерамической поверхности (либо под ней — не понятно) появилось пятно. Они эту плиту всегда совместно с квартирой сдавали в аренду.в особенности желаю отметить духовку, еда в ней прожаривается умеренно со всех сторон. Мое личное мировоззрение, это очень комфортно, а нужен ли он вам либо нет, это решать только вам! Если обесточить плиту и опять включить ее, он врубается опять. Текст всн аннотация по строительству временных дорог для трубопроводного.веб-магазин бытовой техники технохит вы желаете, чтоб ваш дом всегда был заполнен.А на плиту зви 430 у вас есть аннотация?

Термозонд либо термощуп -температурный зонд для мяса сконструирован в виде неопасной иглы, связанной с контрольным центром духовки. Если обратимся к вам за услугой подключения без установки (мебель еще не готова и установку эл. Через четыре месяца эксплуатации увидела, что в нижней части (под ящиками для овощей) накапливается вода. Подскажите цена его подмены, и есть ли у вас консульство в новосибирске? Как подключить электронную плиту как правильно подключить электронную плиту подключение.

New-disk41: Дневник Инструкция К Плите Зви 403 Инструкция К Плите Зви 403 Други, переехала на съемную квартиру, там духовка ЗВИ 430. На крутилках стерлись режимы. Спалила шарлотку, потому что походу врубила гриль. Подскажите, сфотайте если есть дома инструкция, или так напишите по щелчкам.

В тырнете ни один антивирусник не пускает, чтобы скачать. Уже месяц не могу ничего с этим поделать и зарываю кулинарный талант пекаря;( Даже на завод письмо написала, молчат редиски. Выручайте, кулинары.

Ремонт электроплиты своими руками

В статье предложим инструкцию по ремонту электроплиты в домашних условиях. Электроплита – самый мощный бытовой электроприбор. И условия ее эксплуатации не самые комфортные. На ее работоспособность влияют следующие факторы:

• Высокая температура приводит к высыханию и повреждению изоляции;
• Коммутируемые органами управления токи приводят к износу и поломкам переключателей;
• Загрязнения от готовящейся пищи, попадающие внутрь плиты, при достаточном количестве могут привести к поломкам.

Ремонт электроплиты своими руками: основные сложности

Ремонт электроплит усложняется в зависимости от:

• Числа конфорок;
• Наличия духового шкафа;
• Количества ступеней или плавной регулировки мощности конфорок.

Тем не менее, отремонтировать плиту может каждый, кто способен держать в руке отвертку и разобраться в электрической схеме электроплиты.

Для тех, кто имеет уже опыт ремонта, схема не всегда нужна. Она также не потребуется при поиске большинства типовых неисправностей, встречающихся у электроплит. Вот они:

• Обрыв проводников, окисление контактных соединений;
• Выход из строй конфорки;
• Поломка переключателя или регулятора.

Рассмотрим, как найти и устранить эти неисправности.

Не работает плита – с чего начать? Инструкция

Сначала проверяем напряжение питающей сети. Начинать нужно с розетки: однофазной или трехфазной, к которой подключена плита. При питании от трех фаз измеряется напряжение между всеми фазами и нулевым рабочим проводником (должно быть 220 В), а также между всеми фазами (должно быть 380 В). При однофазном питании производим одно измерение – между фазой и нулем.

Если розетка исправна, проводим те же измерения на вводном клеммнике электроплиты. Если на нем будет чего-то не хватать, то виноват кабель электропитания.

Корпуса электроплит заземляются. Но если по каким-то причинам заземление отсутствует, то при поломках плит нужно сразу проверить, не появилась ли на корпусе «фаза». Для этого используется однополюсный индикатор напряжения. Так как корпус окрашен, делать это желательно на шляпках болтов и на конфорках, включив их предварительно в работу. Если «фаза» обнаружена, то продолжать ремонт надо с осторожностью.

Если плита заземленная «бьется» током, то придется поискать две причины: сначала – куда пропала связь с контуром заземления, а затем – в каком месте электроплиты утечка.

В случае, если питающее напряжение в норме, потребуется определить масштабы поломки. Если не работает отдельный элемент (конфорка, духовой шкаф), то искать неисправность нужно в ее цепи. Если не работает вся плита или часть конфорок – потребуется проверка общих цепей питания. При наличии нескольких режимов работы конфорок и духового шкафа нужно заранее выяснить, все ли они включаются. Для этого потребуется время, так как конфорки придется по нескольку раз нагревать и остужать.

Отсутствие индикации работы конфорки не всегда означает, что она неисправна. Возможно, не горит индикаторная лампа.

Итак, район поиска сужен до минимума. Обесточиваем плиту, вынув вилку питания из розетки, и разбираем ее. У переносных плит для этого удаляем крышку внизу, у стационарных – откручиваем пару винтов и поднимаем верхнюю крышку.

Делаем внешний осмотр. Обращаем внимание на надежность крепления разъемных электрических соединений, состояние изоляции проводов, наличие запахов горелой изоляции и состояние поверхностей коммутационных элементов. Часть неисправностей определяется как раз таким образом. Если это не помогло – читаем дальше.

Про подключение электроплиты читайте в статье: «Подключение электроплиты: основные вопросы»

Ремонт контактных соединений

Поскольку токи, потребляемые нагревательными элементами плиты, большие, то и требования к качеству контактных соединений предъявляются высокие. А соединений в кухонной плите много: нагревательные элементы подключаются через переключатели, а они – соединяются между собой в общую цепь.

Коммутация производится с помощью разъемов, провода к которым присоединяются опрессовкой. Паять нельзя – под действием температуры соединение разрушится. Сами разъемы должны плотно фиксироваться на выводах элементов. Стоит им ослабнуть, как в этом месте появляется переходное сопротивление. Под действием тока нагрузки оно греется, поверхность окисляется, нарушается контакт. Найти место обрыва можно по почерневшему разъему и обгоревшей изоляции провода.

Разъем придется отрезать и заменить новым, а изоляцию провода – восстановить. Для ремонта проводов в электроплитах изолентой пользоваться нельзя – она расплавится и сгорит. Для этого годятся специальные трубки из стекловолокна, продающиеся в магазинах электротоваров.

Новый разъем приобретается там же, еще для этой цели годятся автомобильные разъемы того же размера. Продаются изделия из латуни, у которых больше недостатков, чем достоинств. Самый главный – без специального инструмента опрессовать его на проводе не получится. Можно, воспользовавшись двумя пассатижами, завернуть его фиксаторы, одна пара которых зажимает провод, а другая – его изоляцию. Но потребует этот процесс максимума упорства.

Второй их недостаток – если гибкий провод зажать еще можно, то жесткий, сечением до 6 мм² –нереально. Если прочного обжима не получится – через некоторое время придется проделать это снова, но опять с новым разъемом.

Лучше дело обстоит с изолированными наконечниками. Для их обжима тоже потребуются пресс клещи, они недорого стоят и пригодятся в дальнейшем.

Наконечников выпускается много:

В плитах применяются разъемы РПИ-М,

но для соединения под винт используются и НКИ, НВИ.

Диагностика нагревательных элементов

Нагревательные элементы (ТЭНы) проверяются мультиметром, для чего измеряется их сопротивление. Оно находится в пределах сотен Ом. Низкое сопротивление указывает на короткое замыкание в ТЭНе (при этом должен отключаться автоматический выключатель питания электроплиты), бесконечность указывает на обрыв элемента. В обоих случаях его придется поменять.

Конфорки могут иметь 4 вывода, в этом случае в них содержатся два нагревательных элемента. Это нужно для ступенчатой регулировки мощности. Элементы имеют разную мощность и разное сопротивление.

Нагревательный элемент не должен иметь электрической связи с корпусом. При ее обнаружении элемент меняют.

Диагностика переключателей

Работа переключателей проверяется мультиметром. Для этого иногда приходится сравнивать его диаграмму работы с соседним исправным или посмотреть на принципиальную схему плиты. Обнаруженные подгоревшие контакты зачищают наждачной бумагой, разобрав переключатель. Но, если он сильно поврежден, лучше заменить элемент на новый. Если в плите есть регулятор температуры, то его контакты тоже проверяются мультиметром. В холодном состоянии они замкнуты.

Оцените качество статьи:

— Настоящая итальянская печь для пиццы

Эти шаги имеют решающее значение для долговечности духового шкафа. НЕ торопитесь, и вы будете наслаждаться своей духовкой очень долго!

Отверждение — это процесс постепенного и равномерного высушивания духовки от влаги, которая могла накопиться в духовке на этапах сборки и сборки.
В процессе нагрева происходит тепловое расширение, и для сохранения той же скорости расширения и предотвращения структурных трещин материалы должны быть как можно более сухими.
Небольшие линии расширения волос являются нормальным явлением и не повлияют на производительность вашей печи, в то время как более крупные структурные трещины могут снизить ее эффективность и вызвать проблемы в будущем, так что это шаг, который вы не хотите пропустить или спешить! Хотя устранение пожаров не обязательно должно происходить в последовательные дни, наилучшие результаты были достигнуты, если между циклами нагрева не более двух дней.

Целью обработки дровяной печи для пиццы Subito Cotto является постепенное повышение температуры внутри духовки (не более 50 градусов C / час) во избежание теплового удара.Чтобы добиться этого, разожгите небольшой огонь в отдельном месте, например, в угольном дымоходе, и ставьте сковороду в духовку только тогда, когда интенсивность пламени уменьшится (вы хотите, чтобы пламя не касалось купола).
Добавьте угли или небольшое количество дров для разжигания огня, избегая при этом больших кусков, которые могут вызвать сильное пламя, перемещая сковороду внутри духовки каждые 30 минут или около того, чтобы обеспечить равномерное нагревание всего пола.

Когда вся ваша духовка нагреется до 200 градусов Цельсия (купол, стены и пол), поддерживайте эту температуру около 2 часов, дайте огню погаснуть и дайте вашей духовке вернуться к температуре окружающей среды.

Вам нужно будет повторять эти шаги для каждого закрепляющего огня со следующими целевыми температурами:

• 1-й огонь 200 ° C / 2 часа
• 2-й огонь 250 ° C / 3 часа
• 3-й огонь 300 ° C / 2 часа

Оставшийся огонь можно разжечь прямо в духовке, если огонь небольшой и вы позволяете духовке медленно нагреваться. Если вы приобрели духовку с газовой горелкой, вы можете начать ее использовать, чтобы продолжить отверждение. Продолжайте сушить печь по следующему графику:

• 4-й огонь 350 ° C / 2 часа
• 5-й огонь 400 ° C / 2 часа

Теперь ваша духовка затвердела, и вы можете приступить к приготовлению!

Ваша духовка будет выделять воду во время отверждения, когда она будет поддерживать постоянную температуру до тех пор, пока она не прекратится, а затем возобновит огонь для отверждения.С технической точки зрения вода будет вытекать до тех пор, пока вся печь не достигнет 350 градусов Цельсия 3 или 4 раза, поэтому нет ничего необычного в том, чтобы увидеть воду даже после нескольких пожаров. По мере отверждения вы можете увидеть небольшие линии расширения, это нормально, но они раздражаются слишком большим нагревом слишком рано, поэтому всегда нагревайте духовку постепенно.
Если ваша духовка когда-либо страдала от проникновения воды, дайте ей полностью высохнуть в течение как минимум 7 дней (вы можете использовать небольшой обогреватель для уменьшения влажности), а затем снова высушите.Мы также рекомендуем мини-отверждение после длительных периодов бездействия, а если вы будете использовать духовку в зимние месяцы, осторожно нагрейте ее, чтобы предотвратить термический шок.

Для вашего дальнейшего удовольствия, пожалуйста, следуйте этим простым правилам, которые можно и нельзя

% PDF-1.4 % 115 0 объект > эндобдж xref 115 84 0000000016 00000 н. 0000003090 00000 н. 0000003177 00000 н. 0000003690 00000 н. 0000004162 00000 п. 0000004599 00000 н. 0000005231 00000 п. 0000006009 00000 н. 0000006285 00000 н. 0000006469 00000 н. 0000006729 00000 н. 0000006986 00000 н. 0000007613 00000 п. 0000007727 00000 н. 0000007775 00000 н. 0000007823 00000 н. 0000008506 00000 н. 0000008771 00000 п. 0000010214 00000 п. 0000010356 00000 п. 0000010532 00000 п. 0000011747 00000 п. 0000011998 00000 н. 0000012174 00000 п. 0000012471 00000 п. 0000014080 00000 п. 0000014630 00000 п. 0000014893 00000 п. 0000015483 00000 п. 0000017026 00000 п. 0000017158 00000 п. 0000017185 00000 п. 0000017493 00000 п. 0000018879 00000 п. 0000020275 00000 п. 0000020740 00000 п. 0000021006 00000 п. 0000021534 00000 п. 0000021932 00000 п. 0000023551 00000 п. 0000024683 00000 п. 0000033781 00000 п. 0000053777 00000 п. 0000065266 00000 п. 0000065336 00000 п. 0000065421 00000 п. 0000080020 00000 п. 0000080283 00000 п. 0000080450 00000 п. 0000105576 00000 н. 0000119375 00000 п. 0000148009 00000 н. 0000148062 00000 н. 0000148115 00000 н. 0000148185 00000 н. 0000148267 00000 н. 0000151741 00000 н. 0000152014 00000 н. 0000152187 00000 н. 0000152214 00000 н. 0000152512 00000 н. 0000156933 00000 н. 0000157216 00000 н. 0000157576 00000 н. 0000163589 00000 н. 0000163857 00000 н. 0000164154 00000 н. 0000182449 00000 н. 0000182698 00000 н. 0000182995 00000 н. 0000189309 00000 н. 0000189575 00000 н. 0000189963 00000 н. 0000206236 00000 п. 0000206587 00000 н. 0000206861 00000 н. 0000207090 00000 н. 0000207402 00000 н. 0000207669 00000 н. 0000207973 00000 н. 0000234140 00000 н. 0000234636 00000 н. 0000235086 00000 н. 0000001976 00000 н. трейлер ] / Назад 9250234 >> startxref 0 %% EOF 198 0 объект > поток hb«b`g`g`l`e @

Инновационный наномодулятор NRF2 вызывает ферроптоз рака легких и вызывает иммуностимулирующее микроокружение опухоли

Abstract

Одновременное нацеливание как на микросреду опухоли, так и на раковые клетки с помощью одного о наномедицине на сегодняшний день не сообщалось.Здесь мы сообщаем о двойных свойствах наночастиц с нулевым валентным железом (ZVI-NP) для индукции специфической для рака цитотоксичности и противоракового иммунитета.

Методы: Специфическая для рака цитотоксичность, индуцированная ZVI-NP, определялась с помощью МТТ-анализа. Функциональный анализ митохондрий, иммунофлуоресцентное окрашивание, вестерн-блоттинг, RT-qPCR и ChIP-qPCR были использованы для анализа механизма, лежащего в основе ZVI-NP-индуцированной гибели ферроптотических раковых клеток. Терапевтический потенциал ZVI-NP оценивали на иммунокомпетентных и гуманизированных мышах.Профили иммунных клеток аллотрансплантатов и ex vivo культивированных иммунных клеток исследовали с помощью анализа проточной цитометрии, анализа RT-qPCR и иммунофлуоресценции.

Результаты: ZVI-NP вызывал дисфункцию митохондрий, внутриклеточный окислительный стресс и перекисное окисление липидов, что приводило к ферроптотической гибели клеток рака легких. Расщепление NRF2 GSK3 / β-TrCP посредством активации AMPK / mTOR усиливалось при таком специфичном для рака ферроптозе. Кроме того, ZVI-NP ослаблял способность к самообновлению рака и подавлял гены, связанные с ангиогенезом.Важно отметить, что ZVI-NP усиливал противоопухолевый иммунитет, сдвигая проопухолевые макрофаги M2 на противоопухолевые M1, уменьшая популяцию регуляторных Т-клеток, подавляя PD-1 и CTLA4 в Т-клетках CD8 ⁺ , чтобы усилить их цитолитическую активность против раковых клеток, при ослаблении экспрессии PD-L1 в раковых клетках in vitro и у несущих опухоль иммунокомпетентных мышей. В частности, ZVI-NP преимущественно накапливаются в тканях опухоли и легких, что приводит к заметному подавлению роста опухоли и метастазирования.

Выводы: Эта двойная функциональная наномедицина установила эффективную стратегию синергетического индуцирования гибели ферроптотических раковых клеток и перепрограммирования иммуносупрессивной микросреды, что подчеркивает потенциал ZVI-NP как передовой комплексной противораковой стратегии.

Ключевые слова: наночастица , NRF2, ферроптоз, микросреда опухоли, рак легкого загрязняющие вещества из-за его сильного восстановительного потенциала и широкой доступности ¹ .ZVI-NP может генерировать массивные активные формы кислорода (ROS) посредством реакции Фентона и других химических процессов ² . Несмотря на большое внимание к восстановлению окружающей среды, меньше исследований по противоопухолевой эффективности как в раковых клетках per se , так и в иммунной модуляции в микроокружении опухоли (TME) в исследованиях in vitro, и in vivo, . Ранее мы обнаружили, что покрытый серебром ZVI-NP (ZVI @ Ag) может быстро превращаться в ионы железа за счет усиления лизосомной функции раковых клеток ³ .ZVI-NP быстро превращался в ионы железа, преимущественно в лизосомах раковых клеток, но не в лизосомах нормальных клеток из-за их более кислого внутриорганического компартмента в злокачественном состоянии. Быстрое высвобождение ионов железа дополнительно индуцировало выброс ROS в раковых клетках и повреждение субклеточных органелл, что приводило к ферроптозу ³ . Кроме того, ZVI-NP, покрытый карбоксиметилцеллюлозой (ZVI @ CMC), имеющий биосовместимую органическую оболочку ⁴ , может индуцировать перекисное окисление липидов и запускать ферроптоз в раковых клетках ⁵ .Тем не менее, лежащий в основе молекулярный механизм ZVI-NP-индуцированного ферроптоза и влияние ZVI-NP на опухоль-ассоциированные иммунные клетки остаются неуловимыми.

Ферроптоз — это новая запрограммированная гибель клеток, выявленная в последние годы. Он характеризуется накоплением внутриклеточного железа и перекисным окислением липидов в процессе гибели клеток. ⁶ . Ферроптозные клетки морфологически характеризуются небольшими митохондриями с разрывом мембраны и исчезновением криста ^{7 , 8} , которые, очевидно, отличаются от некроза, апоптоза и аутофагии.Все больше данных показывает большой потенциал запуска ферроптоза в качестве эффективной противораковой терапии для искоренения злокачественных новообразований ^{9 , 10} . Например, сорафениб, одобренный FDA противораковый препарат, был идентифицирован как индуктор ферроптоза, блокируя синтез глутатиона (GSH) ¹¹ . Однако сорафениб может вызывать серьезные клинические побочные эффекты, включая опасные для жизни сердечно-сосудистые события. ^{12 , 13} .Поэтому разработка противораковых стратегий путем индукции ферроптоза с более высокой эффективностью при одновременном повышении безопасности имеет большое значение.

Иммунотерапия рака за счет усиления собственной иммунной системы пациента для устранения раковых клеток произвела революцию в области лечения рака за последнее десятилетие. Однако существенная польза от иммунотерапии наблюдается только у ограниченной части онкологических больных ^{14 — 16} . Недавно сообщалось, что несколько НЧ вызывают модуляцию микросреды опухоли, такую ​​как репрограммирование макрофагов НЧ диоксида марганца ¹⁷ или магнитными НЧ ^{18 , 19} , а также стимулирование противоопухолевых цитотоксических Т-клеток. функции с помощью NPs гранзима B ²⁰ , а также усиленного рекрутирования цитотоксических Т-клеток в сайт опухоли с помощью нацеленных на антитела NPs ²¹ .Более того, экспрессия профагоцитарного кальретикулина, функционирующего как сигнал «съешь меня», может быть усилена на раковых клетках с помощью НЧ на основе марганца ²² . Тем не менее, биосовместимость и крупномасштабное производство по-прежнему остаются главными проблемами в разработке противораковых наномедицин. Соответственно, ZVI-NP, эффективно доставляющий большое количество железа в раковые клетки, может служить многообещающей стратегией для индукции ферроптоза опухоли. Кроме того, то, как ZVI-NP модулирует иммунные ответы, также заслуживает дальнейшего изучения.

В этом исследовании мы оценили потенциальную роль нашего недавно разработанного ZVI-NP в модуляции микроокружения опухоли на моделях рака легких и проанализировали молекулярные механизмы, участвующие в индукции ферроптоза. Мы определили новый механизм, с помощью которого ZVI-NP усиливает зависимое от фосфорилирования убиквитинирование и деградацию фактора 2, связанного с ядерным фактором E2 (NRF2), основного регулятора транскрипции клеточного окислительно-восстановительного гомеостаза, и тем самым запускает гибель ферроптотических клеток из-за чрезмерного окислительного стресса и перекисное окисление липидов.Кроме того, ZVI-NP ослаблял способность раковых клеток к самообновлению и подавлял ангиогенез эндотелиальных клеток. Следует отметить, что наши результаты показали, что ZVI-NP перепрограммировал поляризацию ассоциированных с опухолью макрофагов в направлении противоопухолевого фенотипа M1 и увеличил цитотоксическую функцию Т-клеток CD8 ⁺ , а также снизил пропорцию регуляторных Т-клеток для повышения противоопухолевого иммунитета в наши модели ex vivo и in vivo . Нанотерапевтические препараты ZVI, интегрированные с двойным нацеливанием как на раковые клетки, так и на микросреду опухоли, существенно открыли потенциал для новой передовой терапии рака с уменьшенными побочными эффектами и повышенной эффективностью.

Материалы и методы

Получение НЧ ZVI @ Ag и ZVI @ CMC

НЧ ZVI @ Ag и ZVI @ CMC были синтезированы, как описано в предыдущих исследованиях ^{3 , 5} . Вкратце, для синтеза ZVI @ Ag дегидрат сульфата железа (FeSO ₄ ) и тринатрийцитрата (Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇ ) смешивали в деионизированной воде с помощью магнитной мешалки. Затем к смеси по каплям добавляли боргидрид натрия (NaBH ₄ ) и перемешивали при комнатной температуре с образованием ZVI.Наконец, при перемешивании добавляли нитрат серебра (AgNO ₃ ), чтобы получить НЧ ZVI @ Ag. Для синтеза ZVI @ CMC сульфат железа (FeSO ₄ ) и карбоксиметилцеллюлозу (CMC) смешивали в перемешиваемой дистиллированной воде с последующим добавлением боргидрида натрия (NaBH ₄ ) к перемешиваемой смеси при комнатной температуре для сборки ZVI @ CMC NPs. . В конечном итоге оба раствора НЧ несколько раз промывали этанолом и собирали с помощью магнитной платформы. Приготовление наночастиц ZVI @ Ag или ZVI @ CMC проводили в среде газообразного аргона.Гидродинамическое распределение ZVI-NP по размерам, измеренное с помощью динамического светорассеяния при комнатной температуре, было выполнено с использованием анализатора частиц Delsa Nano C (Beckman Coulter, Бреа, Калифорния, США).

Анализ гемолиза

Для анализа гемолитической активности ZVI-NP инкубировали с эритроцитами (RBC) и суспендировали при 37 ° C в течение 1 часа, затем центрифугировали при 3000 об / мин в течение 5 минут. Triton X-100 и PBS использовали для создания положительного (100% гемолиз) и отрицательного (0% гемолиз) контролей соответственно.Поглощение супернатанта измеряли при 545 нм.

Клеточные линии и условия культивирования

Клеточные линии рака легких человека h2299, h560, A549, мышиная карцинома легких Льюиса (LLC) и линии клеток фибробластов легких человека MRC-5 и IMR-90 были приобретены у American Tissue Culture Company (Rockville , Мэриленд, США). Клеточная линия Luciferase-LLC (LLC-luc) была предоставлена ​​доктором Мух-Хва Ян (Институт клинической медицины, Национальный университет Ян-Мин, Тайвань). Эти клеточные линии поддерживали в среде DMEM (Gibco, Grand Island, NY, USA).Линия моноцитарных клеток человека THP-1 была приобретена в Центре сбора и исследования биоресурсов (BCRC, Тайвань) и поддерживалась в среде RPMI 1640 (Gibco). В среду DMEM и RPMI 1640 добавляли 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS; Gibco) и 1% пенициллин / стрептомицин (Gibco). Линия эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) была предоставлена ​​доктором Ли-Вха Ву (Институт молекулярной медицины, Национальный университет Ченг Кунг, Тайвань). Клетки HUVEC, культивированные в чашках, покрытых 0,1% желатином в течение 1 ч, поддерживали в среде для роста эндотелиальных клеток-2 (EBM-2; Lonza, Walkersville, MD, USA) и дополняли набором факторов роста SingleQuots ^TM ( Лонза).Все клетки инкубировали при 37 ° C с 5% CO ₂ .

Выделение спленоцитов мыши

После умерщвления мышей C57BL / 6 селезенки собирали в асептических условиях и трижды промывали PBS. Для получения суспензии отдельных клеток селезенки измельчали ​​и пропускали через нейлоновый фильтр для клеток 70 мкм (Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA), а затем эритроциты лизировали и удаляли. Спленоциты тщательно ресуспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS и 1% пенициллин / стрептомицин.

Дифференцировка регуляторных Т-клеток (Tregs)

После выделения спленоцитов клетки инкубировали со средой RPMI 1640, содержащей 10% FBS, 1% пенициллин / стрептомицин, связанные с планшетом анти-CD3 и анти-CD28 антитела (BD Biosciences, Сан-Хосе , Калифорния, США), рекомбинантный мышиный 5 нг / мл IL-2 и рекомбинантный человеческий TGF-β для дифференцировки Treg.

Анализ цитотоксических Т-лимфоцитов с люциферазой

После выделения спленоцитов 1 × 10 ⁴ лимфоцитов затем инкубировали с 1 × 10 ³ клеток LLC-luc на лунку (96-луночный планшет), содержащих 100 мкл среды RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и 1% пенициллин / стрептомицин.Во время совместного культивирования наивные лимфоциты активировались стимуляцией с использованием связанных с планшетом антител к CD3 и анти-CD28, интерлейкина (IL) -2 (супернатант культуры EL-4) и IL-7 (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США). США), инсулин-трансферрин-селен (ITS; Gibco) и β-меркаптоэтанол (SERVA, Heidelberg, Германия), как описано ранее ²³ . После 24 ч совместного культивирования культуральную среду удаляли, а осадок клеток дважды промывали PBS. Количество жизнеспособных клеток LLC-luc определяли с помощью люциферазных анализов с использованием системы анализа люциферазы Dual-Glo (Promega, Мэдисон, Висконсин, США), как описано ранее ²⁴ .

Выделение макрофагов, происходящих из костного мозга мыши (BMDM)

Выделенные кости были собраны в асептических условиях с задних ног мышей C57BL / 6 и мышечные ткани были удалены. Костный мозг вымывали из костей с помощью иглы 25 калибра, прикрепленной к шприцу, содержащему среду для роста BMDM, которая состоит из DMEM, 20% среды, кондиционированной клетками L929, для образования M-CSF (фактор, стимулирующий колонии макрофагов), 10% FBS и 1% пенициллин / стрептомицин. Затем BMDM позволяли дифференцироваться в течение 7 дней при 37 ° C с 5% CO ₂ , и среду для роста меняли каждые 2 дня во время культивирования ex vivo .

Дифференцировка и поляризация макрофагов THP-1

Макрофагоподобное состояние индуцировали обработкой моноцитов THP-1 в течение 48 часов 100 нг / мл форбола 12-миристат 13-ацетата (PMA; Sigma-Aldrich, St. Louis, Миссури, США) в 6-луночных планшетах при плотности 5 × 10 ⁵ клеток / лунку. После двукратной промывки культуральной средой покоящиеся макрофаги (M0) обрабатывали 20 нг / мл IFNγ плюс 1 мкг / мл LPS в течение 6 часов для дифференцировки в фенотип M1 или 20 нг / мл IL-4 в течение 24 часов для Фенотип M2.Клетки поддерживали в 5% CO ₂ при 37 ° C во время дифференцировки и поляризации.

Система совместного культивирования макрофагов и раковых клеток

Для системы совместного культивирования LLC / BMDM нижний отсек 6-луночного планшета был засеян BMDM (1 × 10 ⁶ ), а верхний отсек — клетками LLC (1 × 10 ⁶ ). Клетки культивировали с ростовой средой BMDM, содержащей или не содержащей ZVI-NP, в течение 48 ч при 37 ° C с 5% CO ₂ . BMDM были собраны для дальнейшего анализа.Для системы совместного культивирования макрофагов A549 / THP-1 нижний отсек 6-луночного планшета был засеян клетками A549 (1 × 10 ⁶ ), а верхний отсек макрофагами THP-1 (M0) (1 × 10 ⁶ ). Клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS, и обрабатывали ZVI-NP или нет в течение 48 ч при 37 ° C с 5% CO ₂ . Клетки A549 собирали для дальнейшего анализа.

Анализ жизнеспособности клеток

Анализ жизнеспособности клеток выполняли для оценки цитотоксичности ZVI-NP с использованием 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ) или набора для подсчета клеток. 8 (CCK-8) анализ.После обработки ZVI-NP клетки заменяли свежей средой, содержащей 1 мг / мл МТТ (Sigma-Aldrich) или реагентом CCK-8 (Dojindo Laboratories, Кумамото, Япония), а затем инкубировали при 37 ° C в течение 2 часов. Для анализа МТТ кристаллы растворяли в диметилсульфоксиде и измеряли оптическое поглощение при 570 нм. Для анализа CCK-8 измеряли оптическое поглощение при 450 нм.

Анализы миграции заживления ран и инвазии через лунки

Для анализа миграции заживления ран клетки A549 и h560 (1 × 10 ⁵ ) засевали в каждый отсек культуральной вставки (Ibidi, Martinsried, Германия).Бесклеточный зазор размером 500 мкм создавался после удаления вставки, и клетки обрабатывали ZVI-NP во время процесса миграции. Для анализа инвазии через лунки 5 × 10 ⁵ клеток высевали на верхнюю сторону мембраны через лунки (Falcon), которая была предварительно покрыта матригелем (Corning, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США) за день до посева клеток. После обработки ZVI-NP в течение 16 ч прикрепленные на обратной стороне мембраны клетки фиксировали и окрашивали. Случайные виды анализа миграции и инвазии были сфотографированы Olympus CKX53 (Olympus, Токио, Япония) и проанализированы с помощью программного обеспечения ImageJ.

Анализ образования раковых сфер

Клетки h560 и h2299 высевали в 6-луночные планшеты с ультранизким прикреплением с DMEM / F12, содержащей добавку N-2 (Invitrogen, Foster City, CA, USA), 20 нг / мл фактора роста эпителия. (PeproTech Inc., Роки-Хилл, Нью-Джерси, США), 20 нг / мл основного фактора роста фибробластов (PeproTech Inc.) и 1% пенициллин / стрептомицин в количестве 2 × 10 ⁴ клеток на лунку. Клетки инкубировали в течение 7 дней, а затем обрабатывали ZVI-NP или без него в течение 48 часов. Сферы рака, состоящие из 20 или более клеток, фотографировали и подсчитывали.

Анализ трансвеллентной миграции эндотелиальных клеток

клеток HUVEC (1 × 10 ⁵ ) высевали в верхние камеры трансвеллеров (Falcon) с бессывороточной средой DMEM. Нижние камеры заполняли средой DMEM, содержащей 20% FBS плюс ZVI-NP, а затем инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов. Клетки, прикрепленные на обратной стороне мембраны, окрашивали кристаллическим фиолетовым и подсчитывали под прямым микроскопом (Nikon E400, Токио, Япония).

Анализ образования пробирок

Матригель без фенолового красного (Corning) добавляли в 96-луночные планшеты и затем инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа.Клетки HUVEC (2 × 10 ⁴ на лунку) высевали в 96-луночные планшеты с культуральной средой, содержащей ZVI-NP или нет, а затем инкубировали в течение 8 часов. Образование трубок наблюдали и произвольно фотографировали под микроскопом (Nikon E400).

Измерение внутриклеточных ROS и перекисного окисления липидов

Для измерения внутриклеточного уровня ROS клетки (8 × 10 ⁴ на лунку) высевали в 12-луночные планшеты. После обработки ZVI-NP клетки отделяли трипсином, дважды промывали PBS и затем инкубировали с 10 мкМ H ₂ DCFDA (Sigma-Aldrich) при 37 ° C в течение 30 минут в темноте.После промывания PBS уровни внутриклеточных ROS анализировали с помощью проточной цитометрии (CytoFLEX ^TM , Beckman coulter, Brea, CA, USA). Для определения уровня перекиси липидов клетки инкубировали с 5 мкМ Liperfluo (Dojindo) при 37 ° C в течение 30 минут в темноте. Для измерения внутриклеточного уровня 4-HNE клетки инкубировали с первичным антителом в течение 30 минут на льду, а затем с меченным Alexa Fluor 488 вторичным антителом в течение 30 минут. Флуоресценцию образца измеряли с помощью проточной цитометрии (CytoFLEX ^TM ).

Анализ митохондриальных ROS и потенциала митохондриальной мембраны

Для измерения митохондриальных ROS клетки инкубировали с 5 мкМ MitoSOX (Invitrogen) при 37 ° C в течение 30 минут в темноте. Флуоресценцию образца измеряли с помощью проточной цитометрии (CytoFLEX ^TM ). Для определения потенциала митохондриальной мембраны клетки инкубировали с 20 нМ 3,3-дигексилоксакарбоцианина иодидом (DiOC6) (Enzo, New York, NY, USA) в течение 15 минут или 5 мкг / мл родамина 123 (Sigma-Aldrich) в течение 30 минут при 37 ° C в темноте, а затем анализировали методом проточной цитометрии (CytoFLEX ^TM ).

Измерение функции дыхания митохондрий

Монослои клеток культивировали в микропланшетах для культивирования клеток XF (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA, USA) при плотности 2,5 × 10 ⁴ клеток на лунку. Картридж датчика (Seahorse Bioscience) поляризовали в течение ночи и калибровали. После обработки ZVI-NP среду заменяли соответствующей аналитической средой без бикарбоната натрия и сыворотки, а затем клетки инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C без CO ₂ .Соединения вводили последовательно: 1 мкМ олигомицина; 2 мкМ FCCP; 2 мкМ ротенона (все от Sigma-Aldrich). Базальные ответы OCR и OCR на инъекцию соединений выполняли в анализаторе Seahorse XF24 (Seahorse Bioscience) в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ определения общего АТФ и НАДФН

Общий уровень АТФ измеряли с помощью набора для определения АТФ (Invitrogen). Клетки (8 × 10 ⁴ на лунку) высевали в 12-луночные планшеты. После обработки ZVI-NP клетки лизировали и смешивали с 1X реакционным раствором, а затем инкубировали в течение 5-15 мин.Затем был проведен анализ образца в соответствии с инструкциями производителя.

Для определения уровня НАДФН использовали набор для определения НАДФН (Biovision, Сан-Франциско, Калифорния, США). Клетки (8 × 10 ⁵ ) высевали в 10-сантиметровую чашку. После обработки ZVI-NP клетки лизировали экстракционным буфером, а затем нагревали при 60 ° C в течение 30 мин. Затем экстрагированные образцы наносили в каждую лунку 96-луночного планшета и смешивали с проявителем НАДФН при комнатной температуре в течение 1–4 ч инкубации.Для определения внутриклеточного уровня НАДФН оптическое поглощение при 450 нм измеряли один раз в час в соответствии с инструкциями производителя.

Трансфекция плазмид

Плазмида NRF2 (pCMV3-C-OFP / NFE2L2) была приобретена у Sino Biological Inc. (Пекин, Китай), и трансфекция была проведена с использованием реагента Turbofect (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Через 24 ч трансфекции клетки собирали для анализа перекисного окисления липидов или собирали для экспериментов на животных.

Экстракция РНК и анализы RT-qPCR

После обработки ZVI-NP общую РНК экстрагировали с использованием реагента Trizol (Invitrogen). Очищенную РНК превращали в кДНК обратной транскрипцией. RT-qPCR выполняли с SYBR Green Master Mix (Invitrogen) с использованием системы ПЦР в реальном времени StepOnePlus ™ (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США). Уровни экспрессии нормализовали с помощью β-актина внутреннего контроля. Наборы праймеров перечислены в таблице S1.

Экстракция белка и вестерн-блоттинг

Клетки лизировали в 1 × буфере RIPA (0.05 М трис-HCl, 0,15 М хлорид натрия, 0,25% дезоксихолевая кислота, 1% Nonidet P-40, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ DTT, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, 5 мкг / мл лейпептина и 10 мкг / мл апротинина), содержащий коктейль ингибиторов протеаз (Sigma-Aldrich). Лизаты центрифугировали при 13 200 об / мин в течение 15 мин. Белковые экстракты солюбилизировали в загрузочном буфере (60 мМ трис-основание, 2% SDS, 10% глицерин и 5% β-меркаптоэтанол). Равные количества лизата разделяли на 8% SDS-PAGE и переносили на поливинилдифторидную (PVDF) мембрану.Белок идентифицировали путем инкубации мембраны с первичными антителами, а затем с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. Условия антител описаны в таблице S2.

Анализ иммунопреципитации хроматина (анализ ChIP)

Клетки (5 × 10 ⁶ ) сшивали с последующим приготовлением ядерных лизатов с использованием набора Magna ChIP ^TM protein G (Millipore, Burlington, MA, USA). Ядерные лизаты обрабатывали ультразвуком для сдвига ДНК примерно до 500 п.н. с последующей иммунопреципитацией в течение 16 часов при 4 ° C с использованием IgG или антител против NRF2 (Genetex, Сан-Антонио, Техас, США).Уровни генов-мишеней в продуктах ChIP определяли с помощью RT-qPCR. Используемые праймеры перечислены в таблице S1.

Иммунофлуоресцентный (IF) и иммунохимический (IHC) анализ

Для иммунофлуоресцентного (IF) окрашивания использовали набор для окрашивания Opal (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). После фиксации клеток извлечение антигена проводили с цитратным буфером (pH 6,0) в микроволновой печи. Затем предметные стекла промывали, блокировали и инкубировали с первичным антителом β-TrCP при 4 ° C в течение ночи с последующей инкубацией с полимером вторичного антитела HRP в течение 10 минут и затем с флуорофором Opal в течение 10 минут при комнатной температуре.Для дальнейшего окрашивания антителом против NRF2 слайды снова помещали в цитратный буфер (pH 6,0) и нагревали в микроволновой печи. После окрашивания опалом для окрашивания ядер применяли DAPI.

Для иммунохимического (ИГХ) окрашивания использовали набор Novolink Max Polymer (Leica Biosystems, Вецлар, Германия). Все слайды депарафинизировали с помощью ксилола / этанола, а затем проводили извлечение антигена с помощью TRS-буфера (pH 6,0) в микроволновой печи. После блокировки слайды реагировали с первичными антителами.Пероксидазную активность визуализировали с помощью раствора тетрагидроксихлорида диаминобензидина (DAB). Срезы контрастно окрашивали гематоксилином. Окрашивание в темно-коричневый цвет считалось положительным. Условия антител описаны в таблице S2.

Изображение с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)

ZVI-NP были охарактеризованы с помощью ПЭМ, как описано ранее ^{3 , 5} . Для наблюдения внутриклеточной структуры клетки собирали и инкубировали в течение ночи с фиксирующим раствором (2.5% глутарового альдегида, 3 мМ CaCl ₂ и 0,1 М какодилата). Каждый образец разбавляли абсолютным спиртом и затем наносили на медные сетки с последующей сушкой в ​​вакууме. Цифровые изображения были получены с использованием ТЕМ JEOL JEM1400 (JEOL, Токио, Япония).

Исследование на животных — модели с иммунодефицитом и иммунокомпетентностью

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с установленными руководящими принципами использования и ухода за животными. Для модели ксенотрансплантата h560 мыши с иммунодефицитом 5-6-недельным голым мышам BALB / c (обработка ZVI @ Ag) или мышам NOD / SCID (обработка ZVI @ CMC) подкожно имплантировали 1 × 10 ⁶ клеток h560.Для модели ксенотрансплантата A549 мышей с иммунодефицитом и модели спонтанных метастазов в легкие мышам NOD / SCID в возрасте 5-6 недель подкожно имплантировали 5 × 10 ⁶ клеток A549. Для экспериментальной модели метастазов в легкие клетки h560 (1 × 10 ⁶ клеток / 200 мкл) ресуспендировали в бессывороточной среде и вводили внутривенно (в / в) в хвостовую вену мышей NOD / SCID. Для подкожной модели иммунокомпетентной мыши клетки LLC (5 × 10 ⁵ ) инъецировали в оба бока 6-недельных мышей C57BL / 6.

Когда объем опухоли достигал 40-50 мм ³ , мышей вводили в / в. вводили PBS или ZVI-NP в указанных дозах и в указанное время. Мышей взвешивали, и во время эксперимента измеряли и количественно оценивали объемы ксенотрансплантатов или аллотрансплантатов. Объем опухоли рассчитывали как (длина × ширина квадрата) / 2 в мм ³ . Для анализа метастазирования опухоли легкое вырезали и фиксировали 4% формальдегидом (Sigma-Aldrich) в конце эксперимента. Площадь узелков метастатической опухоли легкого была проанализирована с помощью imageJ.

Исследование на животных — гуманизированные мыши Модель животных

Для получения гуманизированных мышей мононуклеарные клетки периферической крови человека (hPBMC) внутривенно вводили. вводили 6-8-недельным мышам с развитым тяжелым иммунодефицитом (ASID) (NOD.Cg-Prkdc ^scid Il2rg ^tm1Wjl / YckNarl; Национальный центр лабораторных животных, Тайбэй, Тайвань). Через восемь дней после приживления hPBMC клетки h560 (5 × 10 ⁶ ) вводили подкожно в правый бок мышей hPBMC-ASID.Когда объем ксенотрансплантата опухоли достигал 50-200 мм ³ , мышей вводили в / в. с 25 мг / кг ZVI @ CMC четыре раза через день. Мышей взвешивали, и ксенотрансплантаты измеряли и количественно оценивали, как описано выше.

Одноклеточная суспензия ткани и анализ проточной цитометрии

Ткани опухоли переваривали 0,1 мг / мл коллагеназы (Sigma-Aldrich) и 1 мг / мл диспазы II (Sigma-Aldrich) в бессывороточной среде DMEM в течение 30 мин при 37 ° C. ° C, а затем измельчали ​​через сетку для получения суспензии отдельных клеток.Для определения поляризации макрофагов клетки BMDM, опухолевых тканей или мононуклеарных клеток периферической крови окрашивали антимышиными CD11b, CD86 и CD206. Для измерения доли Treg клетки спленоцитов, опухолевых тканей или мононуклеарных клеток периферической крови окрашивали антимышиными CD25, Foxp3 и CD4. Чтобы определить представление PD-1 и CTLA4 на лимфоцитах CD8 ⁺ , клетки спленоцитов, опухолевых тканей или мононуклеарных клеток периферической крови окрашивали антимышиным PD-1, CTLA4 и CD8.Для гуманизированных мышей hPBMC-ASID клетки опухолевых тканей или мононуклеарные клетки периферической крови окрашивали антителами против CD45, CD3, CD4, CD8 и CD25 человека. Условия антител описаны в таблице S2. После процесса окрашивания в соответствии с инструкциями производителя образцы анализировали методом проточной цитометрии (CytoFLEX ^TM ).

Распределение железа в органах

Голых мышей BALB / c (возраст 5-6 недель) вводили внутривенно. вводили 25 мг / кг ZVI-NP или PBS. После лечения основные органы (сердце, легкие, селезенка, печень и почки), опухоли и кровь были собраны в указанное время.Каждый орган гомогенизировали и растворяли в соляной кислоте. Растворы образцов непрерывно встряхивали в течение 2 дней для обеспечения диссоциации железа. Все образцы были отфильтрованы и проанализированы с использованием масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (технология Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США), предоставленной фармацевтическим и научным университетом Чиа Нан, Тайвань.

Статистический анализ

Были проанализированы три независимых эксперимента для клеточных исследований и шесть мышей на группу для исследований на животных, если не указано иное.Двусторонний t-критерий Стьюдента использовался в исследованиях клеток и животных. Данные представляют собой среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. Уровни статистической значимости были выражены как значения p , *, p <0,05; **, p <0,01; ***, р <0,001; нс: незначительно.

Результаты

ZVI-NP проявляет специфическую для рака цитотоксичность

Мы разработали два типа ZVI-NP, включая НЧ с покрытием из серебра (ZVI @ Ag) и с покрытием из карбоксиметилцеллюлозы (ZVI @ CMC).В этом исследовании мы оценили противораковую эффективность и потенциал иммунной модуляции нашего недавно разработанного ZVI-NP на моделях рака легких с использованием различных моделей in vitro, in vivo и ex vivo , как показано на схеме на рисунке S1A. Как показано на ПЭМ-изображениях , рисунок A, и рисунок S1, оба типа наночастиц демонстрируют структуру ядра / оболочки, а средний физический диаметр наночастиц ZVI @ Ag и ZVI @ CMC составляет 81,08 ± 14,29 нм и 70,17 ± 14,4 нм. соответственно (Рисунок S1C, F).С другой стороны, анализ динамического светорассеяния показал, что свежеприготовленные НЧ ZVI @ Ag и ZVI @ CMC были монодисперсными, а их средние гидродинамические размеры составляли 97,1 ± 19,3 нм и 78,8 ± 19,8 нм, соответственно (рис. S1D, G). . Элементный состав ZVI @ Ag был определен в нашей предыдущей работе ³ , и мы дополнительно выполнили анализ FTIR, чтобы подтвердить успешное покрытие CMC на ZVI @ CMC (рисунок S1H). Кроме того, были измерены дзета-потенциалы наночастиц ZVI @ Ag и ZVI @ CMC, которые показаны на рисунке S1I-J.Следует отметить, что, как показано на рисунке S1K-L, как ZVI @ Ag, так и ZVI @ CMC NP не обладают значительными эффектами гемолиза в соответствии с ISO 10993-4.

Морфологическая и биологическая характеристика ZVI-NP с точки зрения специфической цитотоксичности рака. A, ПЭМ-изображения, показывающие морфологию круглой формы и поверхностное покрытие обоих типов НЧ. Масштабная шкала: 50 нм. B, Внутриклеточные концентрации НЧ ZVI @ CMC ( слева, ) и ионов железа ( справа, ) определяли в клетках A549 и MRC-5 после обработки НЧ ZVI @ CMC (10 мг / мл) для 1, 2 , 4, 8 или 24 ч. C, изображения ПЭМ , показывающие присутствие ZVI @ Ag (стрелка) и митохондрии с поврежденными кристами через 24 часа после обработки НЧ (10 мкг / мл). D и E, анализ MTT, показывающий, что как ZVI @ Ag NPs (D), так и ZVI @ CMC NPs (E) дозозависимо ингибируют жизнеспособность клеток рака легких h560, A549 и h2299, не затрагивая клетки фибробластов легких MRC-5 и IMR-90 через 48 часов лечения. F и G, Оба НЧ ZVI @ Ag или ZVI @ CMC не подавляли жизнеспособность клеток ex vivo изолированных BMDM (F) и лимфоцитов селезенки (G) в исследуемых концентрациях (5 и 10 мкг / мл. ) через 72 ч периода лечения. H и I, Биораспределение НЧ ZVI @ Ag (H) или НЧ ZVI @ CMC (I) в основных органах голых мышей, получавших в / в. инъекция разовой дозы (50 мг / кг). Концентрации железа в образцах тканей определяли количественно в указанное время ( n = 5 на группу). Данные были средними ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3 для клеточных анализов). нс: незначительно; *, p <0,05; **, p <0,01; ***, р <0,001.

Мы дополнительно оценили поглощение ZVI @ CMC клетками рака легких человека (A549) по сравнению с доброкачественными клетками фибробластов легких человека (MRC-5) путем измерения внутриклеточных уровней ионов железа по сравнению с уровнем необработанной контрольной группы ( Рисунок B ).Хотя концентрации НЧ ZVI @ CMC были обнаружены как в раке легкого, так и в нормальных клетках легких в ранние моменты времени (1 час и 2 часа) ( слева, , Рисунок B ), внутриклеточные ионы железа быстро увеличивались в клетках A549. , но не в ячейках MRC-5 ( справа , Рисунок B ). Аналогичные результаты наблюдались для НЧ ZVI @ Ag, где, как сообщалось, преобразование ZVI во внутриклеточные ионы железа происходит быстро за счет подкисления эндосомно-лизосомной системы в линиях плоскоклеточной карциномы полости рта, чем в нормальных клетках ³ , что свидетельствует о том, что специфическое для раковых клеток повышенное превращение ZVI-NP.

Затем мы исследовали ультраструктуру ZVI-NP внутри раковых клеток. Изображения ПЭМ проиллюстрировали присутствие НЧ ZVI @ Ag в лизосомах ( стрелка , Рисунок C ) и высвобождение частиц железа в цитоплазму раковых клеток A549, обработанных НЧ. Примечательно, что эти клетки демонстрировали разрыв митохондриальной внешней мембраны и уменьшенную кристу митохондрий с нормальным размером ядра и отсутствием конденсации хроматина ( ниже , Рисунок C ). Эти изменения органелл напоминают морфологические характеристики новой железозависимой запрограммированной клеточной смерти, а именно ферроптоза, как описано ранее ^{6 , 7 , 25} .

Для оценки цитотоксических эффектов, индуцированных НЧ ZVI @ Ag или ZVI @ CMC, клеточными линиями немелкоклеточного рака легкого человека (h560, A549 и h2299), клеточной линией мышиной карциномы легкого Льюиса (LLC) и незлокачественными Клеточные линии фибробластов легких человека (MRC-5 и IMR-90) обрабатывали различными дозами НЧ ZVI @ Ag или ZVI @ CMC в течение 48 часов, а затем подвергали анализу жизнеспособности клеток МТТ (фигура DE ). Обработка как ZVI @ Ag, так и ZVI @ CMC NPs значительно подавляла жизнеспособность клеток рака легких, не проявляя явной цитотоксичности по отношению к незлокачественным клеточным линиям легких.Учитывая наблюдение специфической для рака цитотоксичности, мы дополнительно исследовали жизнеспособность дополнительных нормальных клеток, включая ex vivo выделенных макрофагов костного мозга (BMDM) и лимфоцитов селезенки от мышей C57BL / 6 после ex vivo обработки ZVI @ НЧ Ag или ZVI @ CMC (, рисунок FG ). Ни одна из обработок ZVI-NP не влияла на жизнеспособность ex vivo культивируемых BMDM или лимфоцитов, подтверждая, что ZVI-NP проявлял специфичную для рака цитотоксичность.

Определенное количество железа необходимо для функционирования организма. Однако чрезмерное количество железа связано с образованием ROS и реакциями цитотоксичности ^{26 , 27} . Чтобы проанализировать биораспределение железа в NPs in vivo , мы измерили концентрации железа в органах мышей nude, несущих подкожные ксенотрансплантаты A549, обработанные одним в / в. инъекция ZVI-NP (25 мг / кг) ( Рисунок H-I ). Результаты показали, что как ZVI @ Ag, так и ZVI @ CMC NPs сохраняются в опухоли и легких в течение 120 часов после однократной дозы i.v. инъекция. Примечательно, что сигнал железа был относительно высоким в ткани селезенки в контрольной группе из-за высокого фона гемоглобина. В совокупности эти данные показали, что лечение ZVI-NP проявляло специфическую для рака цитотоксичность в моделях рака легких in vitro , и ZVI-NP преимущественно сохранялись в опухолевых поражениях и легочной ткани in vivo .

ZVI-NP подавляет стволовость рака и ангиогенез

В дополнение к наблюдаемой специфической для рака цитотоксичности, вызванной ZVI-NP, мы дополнительно оценили ингибирующие эффекты ZVI-NP на стволовые клетки рака и ангиогенез в клетках h560 и h2299.Как показано на фиг. A , как ZVI @ Ag, так и ZVI @ CMC NPs уменьшали размер сферы опухоли по сравнению с контролем. Количество сфер было значительно уменьшено обработкой ZVI @ Ag НЧ (, рисунок B-C, ). Важно отметить, что анализ RT-qPCR показал, что обработка НЧ ZVI @ Ag значительно снижала уровни экспрессии генов стволовости рака, включая OCT4 , Nanog и SOX2 ( Рисунок D ). Более того, лечение ZVI-NP значительно подавляло как миграцию, так и способность к инвазии раковых клеток (рис. S2A-C).В совокупности эти результаты показали, что лечение ZVI-NP оказывает противораковое действие на клетки рака легких.

ZVI-NP показал противораковые эффекты и эффекты против ангиогенеза in vitro . A-C, Репрезентативные изображения размера (A) и количества (B), а также количественный анализ раковых сфер (C), полученных из клеток h2299 и h560, обработанных ZVI-NP, были измерены под инвертированным световым микроскопом. D, Экспрессию генов стволовости рака измеряли с помощью RT-qPCR после обработки НЧ ZVI @ Ag в течение 48 часов в h2299 ( слева, ) и h560 ( справа, ). E и F, Репрезентативные изображения трансвеллентной миграции (E) и их количественный анализ (F) эндотелиальных клеток HUVEC, культивируемых в CM, полученных из клеток h2299 или h560, обработанных с НЧ ZVI @ Ag или без них в течение 8 часов. G и H, Типичные изображения микроскопии образования трубок (G) и их количественное определение (H) HUVEC, обработанных НЧ ZVI @ Ag в течение 16 часов. I, Экспрессию генов проангиогенеза измеряли с помощью RT-qPCR после обработки НЧ ZVI @ Ag в течение 48 часов в h2299 ( слева, ) и h560 ( справа, ).Уровни экспрессии мРНК были нормализованы до β-актина . Данные были средними ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3). *, p <0,05; **, p <0,01; ***, р <0,001.

Кроме того, мы обнаружили, что кондиционированная среда (CM), полученная из раковых клеток, обработанных ZVI @ Ag NPs, в течение 8 часов значительно снижала миграционную способность эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) ( Рисунок EF ) и количество пробирок. формирование ( Рисунок GH ) без очевидного снижения жизнеспособности HUVEC (Рисунок S2D).Кроме того, экспрессия генов проангиогенеза, таких как Sonic hedgehog , TGF-β и VEGF , подавлялась после обработки НЧ ZVI @ Ag (, фиг. I, ). В совокупности эти результаты показали, что лечение ZVI-NP ингибирует как стволовость рака, так и ангиогенез in vitro , что может способствовать их комплексной противораковой эффективности.

ZVI-NP вызывает перекисное окисление липидов и ферроптоз при раке

Учитывая морфологические свидетельства ферроптоза, показанные на фиг. Рисунок C , мы дополнительно определили, влияет ли лечение ZVI-NP на функцию митохондрий.Как показано на фиг. , фиг. A, и фиг. S3A, обработка ZVI-NP значительно снижала интенсивности флуоресценции DiOC6 и родамина 123, что указывает на потерю потенциала митохондриальной мембраны в обработанных раковых клетках h2299, h560 и A549. Впоследствии анализ морских коньков и анализ продукции АТФ продемонстрировали снижение скорости потребления кислорода (OCR) (, рисунок B, ) и уровня АТФ (, рисунок C, ) после обработки НЧ ZVI @ Ag. Кроме того, интенсивность флуоресценции MitoSOX была значительно увеличена в клетках, обработанных ZVI @ Ag НЧ, что указывает на накопление митохондриальных активных форм кислорода (mtROS) и усиление окислительного стресса в митохондриях ( Рисунок D ).В совокупности эти данные подтвердили, что НЧ ZVI @ Ag могут вызывать дисфункцию митохондрий и избыточную продукцию mtROS в клетках рака легких.

ZVI-NP вызывал дисфункцию митохондрий, окислительный стресс и перекисное окисление липидов in vitro . A, Потенциал митохондриальной мембраны анализировали методом проточной цитометрии DiOC6 после обработки НЧ ZVI @ Ag. B, Скорость потребления кислорода (OCR) с точки зрения базального ( слева, ) или максимального ( справа, ) дыхания исследовали с использованием анализатора морского конька XF24 после обработки НЧ ZVI @ Ag (10 мкг / мл) в течение 24 часов. C, Биолюминесцентный анализ показал, что уровни общего АТФ дозозависимо подавлялись во всех трех линиях рака обработкой НЧ ZVI @ Ag в течение 24 часов. D, Митохондриальные АФК в трех линиях рака анализировали с помощью проточной цитометрии после обработки НЧ ZVI @ Ag. E, Уровни внутриклеточных ROS измеряли с помощью проточной цитометрии после обработки ZVI @ Ag NPs (5 мкг / мл) с витамином E (100 мкМ) или без него. F, Колориметрический анализ выполняли для определения уровней НАДФН после обработки ZVI @ Ag в течение 24 часов. G, Проточно-цитометрический анализ перекисного окисления липидов для трех раковых клеток, обработанных НЧ ZVI @ Ag (5 мкг / мл) с предварительной обработкой ферростатином (10 мкМ) или без нее. H, Жизнеспособность клеток определяли после совместной обработки НЧ ZVI @ Ag (10 мкг / мл) и витамином C (100 мкМ), витамином E (100 мкМ), ферростатином (10 мкМ) или липроксстатином (10 мкМ). за 48 ч. Данные были средними ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3). *, p <0,05; **, p <0,01; ***, р <0.001.

Поскольку поврежденные митохондрии могут высвобождать высокие уровни ROS в цитоплазму, а внутриклеточный ZVI может также генерировать ROS посредством реакции Фентона, мы затем определили внутриклеточный уровень ROS в раковых клетках после лечения. Как показано на рис. E , обработка НЧ ZVI @ Ag резко увеличила интенсивность флуоресценции DCF, индекса внутриклеточных АФК. Аналогичный результат был получен после обработки НЧ ZVI @ CMC (Рисунок S3B). Кроме того, уровень внутриклеточного НАДФН, указывающий на способность детоксикации АФК, также снижался в раковых клетках после обработки ZVI @ Ag ( Рисунок F ), подтверждая мнение о том, что лечение ZVI-NP снижает системы антиоксидантной защиты и индуцирует внутриклеточные АФК и mtROS. уровни для увеличения окислительного стресса.

Чтобы подтвердить, вызывают ли перекисное окисление мембранных липидов перегрузка железом и окислительный стресс, был проведен анализ статуса перекисного окисления липидов с помощью проточной цитометрии ( Рисунок G ; Рисунок S3C). Уровень перекисного окисления липидов был значительно увеличен после лечения ZVI-NP, и это увеличение подавлялось добавлением канонического ингибитора ферроптоза, ферростатина-1, во все исследованные клетки рака легких. Эти результаты продемонстрировали, что лечение ZVI-NP вызывает чрезмерную продукцию ROS и приводит к ферроптозному перекисному окислению липидов в раковых клетках.

Для дальнейшей проверки того, связана ли гибель клеток, вызванная лечением ZVI-NP от рака, с высокими уровнями ROS и ферроптозным перекисным окислением липидов, обработанные ZVI-NP раковые клетки инкубировали с витаминами-антиоксидантами (витамин C или витамин E), ферроптозом. ингибитор (Ферростатин-1) или ингибитор перекисного окисления липидов (Липроксстатин-1), а затем подвергают измерению ROS или анализу жизнеспособности клеток. Примечательно, что ZVI-NP-индуцированный уровень внутриклеточных АФК значительно подавлялся добавлением антиоксидантного витамина Е (, фиг. E, ; фиг. S3B).Более того, ZVI-NP-индуцированная гибель клеток ослаблялась обработкой витамином C, витамином E, ферростатином-1 или липроксстатином-1 (, рисунок H, ; рисунок S3D), что указывает на то, что специфическая для рака цитотоксичность, вызванная ZVI-NP, зависит от чрезмерный окислительный стресс, который в основном может быть связан с ферроптозом. В совокупности мы идентифицировали модель ферроптозной гибели раковых клеток, с помощью которой ZVI-NP индуцировал чрезмерное количество ROS и приводил к перекисному окислению мембранных липидов, вызывая тем самым ферроптоз клеток рака легких.

ZVI-NP подавляет NRF2-опосредованную программу цитозащиты

Мы далее проанализировали молекулярный механизм, лежащий в основе противораковой эффективности через индукцию ферроптоза с помощью лечения ZVI-NP. NRF2, важный фактор транскрипции, играет важную роль в поддержании клеточного окислительно-восстановительного статуса посредством , регулируя детоксикацию, антиоксидантные ферменты и регенерацию NADPH ²⁸ . Интересно, что мы показали, что уровни экспрессии белка NRF2 и глутатионпероксидазы 4 (GPX4), основного поглотителя пероксидов фосфолипидов, были снижены в клетках рака легких после лечения ZVI-NP ( Рисунок A, ; Рисунок S4A).Кроме того, активность связывания NRF2 с целевой областью промотора антиоксидантных генов SLC7A11 и AKR1C1 и нового антиферроптозного гена AIFM2 ^{29 , 30} были значительно ослаблены при обработке ZVI @ Ag в клетках h560 и A549, как предполагалось с помощью анализа иммунопреципитации хроматина (ChIP) -qPCR (, фиг. B, ). Следует отметить, что уровни экспрессии NRF2, нацеленного на антиоксидантный ген SLC7A11 и гены детоксикации ROS AKR1B1 , AKR1C1 , AKR1C2 и AKR1C3 , были снижены после лечения ZVI-NP (фигура Рисунок C ; S4B).Кроме того, НЧ ZVI @ Ag ослабляли экспрессию генов, кодирующих ферменты, продуцирующие НАДФН, такие как IDh2, ME1 и 6PGD и НАДФН-зависимые ферменты NDUFAF4 и AIFM2 (фигура C ), в соответствии с наше наблюдение за сниженными внутриклеточными уровнями НАДФН ( Рисунок F ). В совокупности эти открытия выявили нарушение NRF2-зависимой программы транскрипции, посредством которой ZVI-NP снижал уровень белка NRF2 и подавлял его транскрипционную активность, а затем снижал экспрессию генов детоксикации АФК, регулируемых NRF2.

ZVI-NP ингибировал регулируемую NRF2 антиоксидантную активность через усиление пути деградации GSK3β / β-TrCP. A, Иммуноблоттинг NRF2 и GPX4 в четырех линиях раковых клеток, обработанных ZVI @ CMC NP в указанных дозах в течение 24 часов. GAPDH использовался в качестве внутреннего контроля. Анализ B, ChIP-qPCR проводили для измерения способности связывания NRF2 с промоторной областью SLC7A11 , AKR1C1 и AIFM2 в клетках, обработанных ZVI @ Ag NPs в A549 ( верхний ) и h560 ( нижний ). C, экспрессию мРНК нижележащих генов NRF2 измеряли с помощью RT-qPCR после обработки НЧ ZVI @ Ag в клетках A549 и h560. Тепловые карты отражают подавление уровней мРНК этих генов по сравнению с соответствующими необработанными контролями. D, Иммуноблоттинг p-AMPK, общего AMPK, p-mTOR, общего mTOR, p-GSK3β и общего GSK3β в клетках, обработанных НЧ ZVI @ Ag ( слева, ) или ZVI @ CMC NP ( справа, ) для указанное время. E, Иммунофлуоресцентное окрашивание NRF2, β-TrCP и DAPI в клетках A549 ( слева, ) и h560 ( справа, ) после обработки НЧ ZVI @ Ag или ZVI @ CMC.Данные были средними ± среднеквадратичное отклонение. ( n = 3). *, p <0,05; **, p <0,01; ***, р <0,001.

Чтобы дополнительно проверить, является ли ZVI-NP-индуцированное ингибирование пути NRF2 основной причиной ферроптоза, мы сверхэкспрессировали NRF2 в клетках рака легких и определили уровень 4-HNE, биомаркера перекисного окисления липидов, после лечения ZVI-NP. . Как показано на фиг. S4C, внутриклеточный уровень 4-HNE повышался после обработки ZVI-NP. Следует отметить, что это увеличение было в значительной степени уменьшено сверхэкспрессией NRF2, предполагая, что индуцированное ZVI-NP ферроптотическое перекисное окисление липидов было преимущественно вызвано ингибированием NRF2.В совокупности наши результаты показали, что модуляция пути NRF2 с помощью ZNI-NPs индуцирует образование ROS, перекисное окисление мембранных липидов и гибель ферропотических клеток.

ZVI-NP усиливает GSK3β / β-TrCP-зависимую деградацию NRF2

Уровень белка NRF2 регулируется путями деградации. Основной путь локализован в цитоплазме и регулируется KEAP1 E3 ubiquitin ligase ³¹ . Второй путь находится в ядре и регулируется GSK3β / β-TrCP зависимой от фосфорилирования системой убиквитинирования ³² .KEAP1-зависимая деградация NRF2 недостаточна в клетках A549 и h560 ^{33 , 34} . Таким образом, мы предположили, что GSK3β / β-TrCP-зависимая система деградации может быть активирована обработкой ZVI-NP. Как показано на фиг. D , обработка ZVI-NP индуцировала фосфорилирование GSK3β на Tyr216, что положительно коррелировало с активностью GSK3β. Кроме того, иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что β-TrCP транслоцировался в ядро ​​вместе со сниженной экспрессией белка NRF2 после обработки ZVI-NP ( фиг. E ).Эти данные показали, что как ZVI @ Ag, так и ZVI @ CMC NPs могут усиливать деградацию NRF2 посредством пути GSK3β / β-TrCP.

Для дальнейшего анализа восходящей передачи сигналов, которая запускает фосфорилирование и активацию GSK3β, мы исследовали уровень мишени рапамицина у млекопитающих (mTOR), критического регулятора роста клеток и метаболического репрограммирования посредством подавления GSK3-опосредованного фосфорилирования субстрата ³⁵ . Интересно, что результаты иммуноблоттинга показали, что обработка ZVI-NP уменьшала фосфорилирование mTOR на Ser2448 ( фиг. D ), указывая на антагонистические отношения между mTOR и GSK3β в обработанных ZVI-NP клетках A549 и h560.Напротив, уровень фосфорилирования AMP-активированной протеинкиназы (AMPK), основного сенсора клеточной энергии, который негативно регулирует путь mTOR, повышался после обработки ZVI-NP (, фиг. D ). В совокупности эти результаты выявили новый механизм деградации белка NRF2, зависящий от фосфорилирования, что ZVI-NP может нарушить путь AMPK / mTOR, чтобы активировать p-GSK3 / β-TrCP и, в свою очередь, разрушить NRF2, что приводит к гибели клеток в условиях окислительного стресса и последующему перекисному окислению липидов. .

ZVI-NP ингибирует активность NRF2 и метастазы в легких

Впоследствии мы собрали конечные точки LLC аллотрансплантатов у мышей для анализа инфильтрирующих опухоль макрофагов и Т-клеток с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии (, рисунок E-H ) и анализа проточной цитометрии (, рисунок I-M, ). Иммунофлуоресцентные изображения показали, что обработка ZVI @ CMC увеличивала инфильтрацию противоопухолевых макрофагов M1 (CD86 ⁺ ) и цитотоксических Т-клеток (CD8 ⁺ ) в центре опухолевых поражений ( область 2, ). Рисунок F, H ) по сравнению с контрольной группой, которая показала преимущественно околопухолевую локализацию макрофагов M1 и CD8 + Т-клеток ( область 2, Рисунок E, G ).Кроме того, анализ проточной цитометрии продемонстрировал, что обработка ZVI @ CMC уменьшала долю M2-подобных макрофагов (, фиг. I, ), но увеличивала долю M1-подобных макрофагов (, фиг. J ) среди связанных с опухолью макрофагов. Кроме того, среди инфильтрирующих опухоль Т-клеток CD8 ⁺ доля клеток PD-1 ⁺ и клеток CTLA4 ⁺ была уменьшена обработкой ZVI @ CMC (, фиг. K-L ). В то же время доля регуляторных Т-клеток, инфильтрирующих опухоль (Tregs, CD25 ⁺ FoxP3 ⁺ ), подмножества CD4 ⁺ Т-клеток, которые оказывают проопухолевое влияние, была снижена после лечения ZVI @ CMC (рис. M ).Кроме того, аналогичные результаты наблюдались в циркулирующей крови обработанных мышей (фиг. S6D-H), указывая на то, что индуцированный ZVI @ CMC противоопухолевый иммунитет был системным.

Для дальнейшего изучения того, как ZVI @ CMC модулирует иммунную систему человека, мы использовали мышей с тяжелым тяжелым иммунодефицитом (ASID), которым имплантировали мононуклеарные клетки периферической крови человека (hPBMC). После приживления hPBMC мышей hPBMC, несущих подкожные ксенотрансплантаты опухоли h560, вводили в / в. инъекция ZVI @ CMC (25 мг / кг) ( Рисунок N ).Как показано на фигуре О , объем опухоли значительно уменьшился после обработки ZVI @ CMC по сравнению с контролем PBS. Масса тела, окрашенные H и E срезы тканей основных органов и анализ биохимии крови мышей не показали очевидной разницы между контрольными группами PBS и ZVI @ CMC NP (, фиг. P ; фиг. S6I-J). Примечательно, что анализ проточной цитометрии показал, что обработка ZVI @ CMC снижает долю Treg среди Т-лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (, фиг. Q ).В совокупности эти результаты предполагают, что лечение ZVI-NP может модулировать иммунитет человека и обеспечивать противоопухолевую эффективность in vivo .

ZVI-NP стимулирует иммунитет макрофагов и лимфоцитов